Исторические вехи цитогенетической диагностики

Цитогенетика — это относительно молодая и интенсивно развивающаяся область современной науки о клеточных основах наследственности и изменчивости, которая изучает структуру и функции хромосом. Предметом медицинской цитогенетики является исследование связи изменчивости хромосом с патологией у человека.

Понимание того, что родители передают свои признаки потомкам, было еще в древности, однако изучение механизма этой передачи было невозможным без технологического прогресса, открывающего новые методы исследования. Появление возможности многократного увеличения объектов позволило рассматривать мельчайшие структуры человеческого тела и дало начало новым наукам, таким как гистология, цитология и другие. Ученые смогли выяснить, что живые организмы состоят из клеток, а различные методы окраски хромосом пролили свет на их структуру и функцию. Вскоре стало понятно, что наследственность как-то связана с ядром.

Впервые хромосомы были идентифицированы в материнских клетках пыльцы традесканции швейцарским ботаником Карлом Вильгельмом фон Нагели (Carl Wilhelm von Nägeli) в 1842 году [1], но тогда еще сам Карл Вильгельм полностью не понимал значения своего открытия. Позднее, в 1870-х годах, Вальтер Флемминг (Walther Flemming), который считается основателем цитогенетики, для визуализации поведения хромосом при митозе применил анилиновый краситель на клетках плавников и жабр саламандры. Поскольку хромосомы связываются с базофильными красителями, Флемминг наблюдал нитевидные структуры в ядре и назвал их хроматином (от древнегреческого χρῶμα — «цвет») [2]. Впоследствии эти нитевидные структуры хроматина также были описаны Вальдейером-Гарцем (Heinrich Wilhelm Gottfried von Waldeyer-Hartz), который в 1888 году ввел термин «хромосомы» (χρῶμα + σῶμα — «тело» в переводе с древнегреческого) [3]. С тех пор проводились различные технические усовершенствования для получения хромосом из клеток, культивируемых in vitro, после остановки их деления в митозе колхицином. Попытки определить количество хромосом в клетках человека заняли десятилетия в начале и середине XX века. В 1923 году Теофилус Пейнтер (Theophilus Shickel Painter) получил данные о 48 хромосомах, анализируя изображения ядер, реконструированных из тонких срезов ткани яичек человека, которые были погружены в парафин и окрашены гематоксилином железа [4]. Эти представления о нормальном числе хромосом в клетках человека сохранялись до 1956 года. Именно в этом году американский цитогенетик индонезийского происхождения Джо Тио (Joe Hin Tjio) и шведский цитогенетик, профессор Альберт Леван (Johan Albert Levan), использовав усовершенствованные методы получения хромосомных препаратов, показали, что соматические клетки человека имеют 23 пары хромосом. Это опровергло представления Пейнтера [5]. Методологические усовершенствования Тио и Левана включали использование культивированных клеток фибробластов эмбрионального легкого, а не разрезанной ткани, остановку деления клеток в метафазе с помощью колхицина и использование гипотонических растворов для облегчения разделения отдельных хромосом. В этом же году Ч. Форд (C. Ford) и Д. Хамертон (J. Hamerton) подтвердили находку Тио и Левана, изучив клетки человеческих тестикул [6]. Подтверждение числа хромосом этими двумя исследованиями возобновило интерес к цитогенетике человека, и многие цитогенетические лаборатории начали неустанно трудиться над разработкой различных методов характеристик хромосом и классификации их в группы.

Появлялись новые методы окраски, позволяющие изучить не только количество, но и структуру хромосом человека. Касперссон и др. [7] использовали квинакриновый иприт для создания флуоресцентного рисунка из чередующихся ярких и темных полос вдоль хромосом. Этот метод известен как Q-окрашивание (рис. 1). G-окрашивание, полученное после протеолитического расщепления хромосом с использованием трипсина, наиболее широко используется в клинических лабораториях для выявления врожденных аномалий, которые включают в себя числовые и структурные хромосомные изменения, и по сей день. Хотя паттерны Q-окрашивания и G-окрашивания хромосом очень похожи, считается, что механизмы их индукции различны. В дополнение к методам Q- и G-окрашивания было разработано R-окрашивание с использованием нагревания хромосом до высоких температур, что позволяло получать на хромосомах обратное (reverse) по отношению к этим окраскам расположение ярких и темных полос [8, 9]. Однако широкого распространения такой метод не получил. Только некоторые клинические лаборатории, например во Франции, предпочитают использовать именно его, поскольку теломерные (концевые) области хромосом при такой окраске ярче, чем при Q- или G-окрашивании. Различные паттерны окраски хромосом обусловлены составом оснований ДНК, входящих в их районы. Арриги и Хсу [10] разработали метод окрашивания, известный как C-окраска, который выявляет гетерохроматиновые районы хромосом, в частности обнаруживает центромерный гетерохроматин и гетерохроматин длинного плеча Y-хромосомы. Методика включает обработку метафазных хромосом раствором гидроксида бария при высокой температуре для денатурации ДНК с последующей инкубацией в физиологическом растворе. Доказано, что C-окрашивание является полезным инструментом для выявления полиморфизма центромерного гетерохроматина и гетерохроматина Y-хромосомы у мужчин.

Безусловно, прогресс в области цитогенетики был напрямую связан и с выдающимися успехами в области фотографии. Исследователи получили возможность запечатлеть полученные препараты хромосом при различном окрашивании и в различные периоды деления клетки.

Разработка и внедрение методов дифференциального окрашивания произвели революцию в исследовании хромосом человека. Как только появилась возможность четко отличать хромосомы друг от друга, их стало можно сортировать и сравнивать. Установление точного числа хромосом — 23 пары, из которых одна пара, X и Y, связана с определением пола — помогло дифференцировать роль различных хромосом, позволив исследователям определить, что изменение числа или структуры хромосом приводит к специфическим генетическим заболеваниям. В частности, французский врач-педиатр Ж. Лежен (Jérôme Jean Lejeune) установил, что наличие дополнительной, третьей, копии хромосомы 21 является причиной синдрома Дауна. В последующем было описано множество других хромосомных синдромов, многие из которых носят имена ученых, описавших их. Значительный вклад в развитие этой области внесли и цитогенетики нашей страны, о которых мы расскажем отдельно в следующих выпусках журнала. 

Вскоре стало ясно, что установление международного стандарта классификации и анализа хромосом имеет решающее значение для повышения качества, точности, согласованности и соответствия между научными и клиническими цитогенетическими лабораториями по всему миру. С этой целью в 1978 году была впервые создана Международная система цитогенетической номенклатуры человека (ISCN) [11], которая впоследствии неоднократно обновлялась и пересматривалась в отношении записи результатов анализа кариотипа и новых методов исследования хромосом.

Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH) способствовала еще одному прорыву в цитогенетике в начале 1990-х годов. В методе флуоресцентной гибридизации in situ используются короткие специфичные последовательности ДНК, называемые зондами, которые являются комплементарными по отношению к последовательностям ДНК. Зонды связываются с соответствующими участками ДНК и благодаря тому, что они маркированы флуоресцентной меткой (флуорохромами), позволяют видеть расположение интересующих генов в составе ДНК или хромосом. В отличие от других методов изучения хромосом, требующих активного деления клетки, FISH можно выполнять на неделящихся клетках, благодаря чему достигается широта применения данного метода. Однако флуоресцентная гибридизация in situ имеет один существенный недостаток: ДНК-зонды являются специфичными только к определенному участку генома, и, как следствие, при одном исследовании можно определить наличие или число копий только этого конкретного участка (или нескольких при использовании многоцветных зондов, многоцветной FISH — mFISH).

Следующим важнейшим прорывом в исследовании хромосом стал метод сравнительной геномной гибридизации (CGH), предложенный в 1992 году Анне Каллиониеми. Первоначально этот метод был разработан для анализа хромосомных микроперестроек в тканях опухолей и позволил совершить прорыв в цитогенетике злокачественных новообразований. В этом варианте в качестве ДНК-зондов выступают геномная ДНК пациента (опытная ДНК) и ДНК здорового индивидуума (референсная ДНК), меченые различными флуорохромами. Их гибридизируют между собой и оценивают интенсивность флуоресценции при использовании специальных компьютерных программ.

В сочетании с кариотипированием это позволяет обнаружить вариации числа копий ДНК (делеции или дупликации), которые являются важной причиной многочисленных генетических состояний.

Современное передовое направление цитогенетики — это микрочиповая технология, или молекулярное кариотипирование. Микрочипы представляют собой специальные носители, на которые нанесено множество (до нескольких миллионов) ДНК-зондов небольшого размера. В результате хромосомного микроматричного анализа исследователь получает информацию о числе копий генов и может идентифицировать даже малейшие («невидимые в микроскоп») потери или прибавки хромосом. Исследователь не смотрит в микроскоп и не видит сами хромосомы. Компьютерный алгоритм представляет виртуальный кариотип на основании полученных данных. Однако и у этой технологии есть ограничения. 

Новые методы позволили описать новые хромосомные микроделеционные и микродупликационные синдромы. Расширилось представление о механизме формирования клинических проявлений при различных хромосомных изменениях. 

Стремительное развитие методов в цитогенетике привело к тому, что в 2016 году цитогенетическая номенклатура была переименована в цитогеномную (ISCN) [12]. Она стала содержать разделы не только стандартной цитогенетики, но и запись результатов исследований методом FISH, CGH, микроматричного анализа хромосом.

В настоящее время для проведения пренатальной диагностики и в качестве анализа первой линии у пациентов с множественными врожденными пороками развития и/или задержкой развития проводится стандартный цитогенетический анализ хромосом с G-окраской. С его помощью можно верифицировать различные трисомии (в том числе трисомию 21-й хромосомы), кольцевые хромосомы, крупные потери и прибавления хромосомного материала. Анализ FISH часто применяется для поиска мозаицизма. Особенно актуально это для спортсменов с синдромом Дауна, принимающих участие в соревнованиях. Им анализ проводят из двух тканей (крови и буккального эпителия). Микроматричный анализ также применяют и в пренатальной диагностике, как анализ первой линии, так и в дополнение к цитогенетическому кариотипированию.

Может показаться, что микрочиповые технологии полностью заменят все свои методы-предшественники. Но это не так. Будущее цитогенетики не в одном методе, а в сочетании нескольких методов исследования. Большинство методов, разработанных в конце XX века, всё еще актуальны в XXI, причем как самостоятельные, так и в качестве дополняющих, для расширения информации, предоставляемой более современными методами. Методы, разработанные для геномики, такие как секвенирование следующего поколения (NGS), дают представление о тех же целях, которые преследует цитогенетика, а именно — о причине наследственного заболевания. И возможно, будущие инновации в цитогенетике объединят то, что является действенным во всех методах прошлого, чтобы найти новые, более эффективные способы сбора цитогенетической информации, а также новые приемы для ответов на вопросы, которые всё еще беспокоят современных клинических генетиков.

Литература

1. Vines S. H. The works of Carl von Nägeli // Nature. 1880. Vol. 23. P. 78–80.
2. Flemming W. Сontributions to the knowledge of the cell and its vital processes // The Journal of Cell Biology. 1965. Vol. 25. P. 3–69.
3. Winkelmann A. Wilhelm von Waldeyer-Hartz (1836–1921): an anatomist who left his mark // Clin Anat. 2007. Vol. 20, № 3. P. 231–234.
4. Painter T. S. Studies in mammalian spermatogenesis II. The spermatogenesis of man // J Exp. Zool. 1923. Vol. 37, № 3. P. 291–336.
5. Tjio J. H., Levan A. The chromosome number of man // Hereditas. 1956. Vol. 42. P. 1–6.
6. Ford C. E., Hamerton J. L. The chromosomes of man // Nature. 1956. Vol. 178. P. 1020–1023.
7. Automatic karyotyping of quinacrine mustard stained human chromosomes / T. Caspersson et al. // Exp Cell Res. 1971. Vol. 67, № 1. P. 233–235.
8. Bobrow M., Madan K. The effects of various banding procedures on human chromosomes, studied with acridine orange // Cytogenet Cell Genet. 1973. Vol. 12, № 3. P. 143–156.
9. Dutrillaux B., Lejeune J. A new technic of analysis of the human karyotype // C R Acad Hebd Seances Acad Sci D. 1971. Vol. 272, № 20. P. 2638–2640.
10. Arrighi F. E., Hsu T. C. Localization of heterochromatin in human chromosomes // Cytogenetics. 1971. Vol. 10, № 2. P. 81–86.
11. An international system for human cytogenetic nomenclature (1978) ISCN (1978). Report of the Standing Commitee on Human Cytogenetic Nomenclature // Cytogenet Cell Genet. 1978. Vol. 21, № 6. P. 309–409.
12. ISCN 2020: An international system for human cytogenomic nomenclature. S. Karger Publishing, 2020. 170 pp.
13. Хромосомы человека: Атлас / А. Ф. Захаров и др. М.: Медицина, 1982. 264 с.